LAPORAN KULTUR JARINGAN (PEMBUATAN MEDIA)

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kultur jaringan tanaman merupakan bagian suatu teknik perbanyakan vegetatif nonkonvensional. Perbedaan teknik ini dibandingkan dengan teknik perbanyakan vegetative konvensional biasanya terletak dalam situasi dan lokasi yang berbeda. Penerapan teknikkultur jaringan tanaman mensyaratkan kondisi di dalam ruangan (laboratorium) dan sifatnyaaseptik (steril dari patogen). Bermuara dalam kondisi yang aseptic, maka perlu dijelaskan bahwa segala aktifitas yang berkaitan dengan jaringan harus dalam kondisi aseptik. Kondisi ini dimulai dari cara:

1. Penyiapan peralatan (alat tanam berbahan logam ataupun gelas).

2. Pembuatan media penanaman.

3. Penanaman (inisiasi dan pemilihan: a. perbanyakan; b.perakaran).

Selain peralatan kultur jaringan, media merupakan salah satu factor utama dalam keberhasilan kultur. Media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam. Media kultur jaringan memiliki karakteristik masing-masing. Artinya tidak semua media dapat digunakan pada semua kultur tanaman. Karena beberapa media yang ada memiliki perbedaan kandungan dan konsentrasi zat-zat yang diperlukan atau digunakan pada kultur.

Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan.  Media kultur  fisiknya dapat berbentuk padat atau cair. Media berbentuk  padat menggunakan  pemadat  media seperti agar. Media kultur yang memenuhi syarat adalah yang mengandung nutrient makro dan mikro dalam kadar dan perbandingan tertentu, sumber energi (sukrosa), serta mengandung berbagai macam vitamin dan ZPT.

B. Tujuan

Praktikum ini bertujaun untuk:

1. Mengetahi dan mempraktikan cara membuat larutan stok
2. Mengetahui dan mempraktikan cara membuat medium MS (Murashige & Skoog)
3. Melakukan sterilisasi medium.

II. TINJAUAN PRAKTIKUM

Media kultur jaringan merupakan faktor penting penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin kebutuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula, protein, vitamin, dan hormon tumbuhan. Berhasilnya kultur jaringan banyak ditentukan selain kondisi aseptic juga oleh media tanam. Campuran media yang satu, dapat cocok untuk jenis tanaman tertentu, tetapi dapat kurang cocok untuk jenis tanaman yang lain.

Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsure murni, tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam media tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades (Rahardja, 1995)

Faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk keberhasilan kultur jaringan yaitu bahan sterilisasinya, kandungan unsur kimia dalam media, hormon yang digunakan, substansi organik yang ditambahkan dan terang atau gelapnya saat inkubasi. Dari sekian banyak permasalahan yang harus diteliti dan diperhatikan adalah komposisi media tumbuh pada kultur jaringan karena sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya (Daisy 1994).

Teknik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan. Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfestasi). Selain itu, zat pengatur tumbuh adalah senyawa organik bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tanaman. (Prawitasari 2005)

III. MATERI PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan

1.       Bahan : Media MS

     a. Unsur hara makro :

          - KNO₃                          = 1.900 mg/l

          - NH₄NO₃                      = 1.650 mg/l

          - CaCl₂.2H₂O                 = 440 mg/l

          - MgSO₄.7H₂O              = 370 mg/l

          - KH₂PO₄                       = 170 mg/l

     b.  Unsur hara mikro :

          - MnSO₄.4H₂O              = 22,3 mg/l

          - ZnSO₄.7H₂O               = 8,6 mg/l

          - MoBO₃                        = 6,2 mg/l

          - KI                                = 0,83 mg/l

          - Na₂MoO₄.2 H₂O         = 0,25 mg/l

          - CuSO₄.5H₂O               = 0,025 mg/l

     c.  Besi :

          - FeSO₄.7H₂O                = 27,8 mg/l

          - Na₂-EDTA.2H₂O        = 37,3 mg/l

     d.  Vitamin :

          - Mio-inositol                 = 100 mg/l

          - Thiamin HCl                = 0,1 mg/l

          - Asam nikotinat            = 0,5 mg/l

          - Piridoksin HCl                        = 0,5 mg/l

          - Glisin                           = 2 mg/l

     e.  ZPT :

          - Sitokinin                      = 1 mg/l

     - Auksin                                  = 1 mg/l

 f.  Bahan pemadat : agar    = 7 g/l

 g.  Sukrosa                          = 30 g/l

 h.  KOH atau NaOH          = 1 M     

 i.   HCl                                = 1 M

2. Alat :

     a.  Tabung erlenmeyer                               h.  Timbangan analitik 

     b. Gelas ukur                                            i.   Botol kultur

     c. Pipet                                                     j.   Otoklaf (autoclave)

     d. Pengaduk kaca                                     k.  Aluminium foil

     e. Magnetic stirrer                                    l.   Karet gelang

     f. Kompor                                                m. Kertas payung

     g. pH meter                                                                       

                                                                      

B. Cara Kerja

1. Pembuatan larutan stok

a.  Larutan stok A, merupakan larutan unsur hara makro, dibuat 10 kali dilarutkan dalam 1000 ml aquades.

b.  Larutan stok B, merupakan larutan hara mikro, dibuat 1000 kali dalam 100 ml aquades.

c.  Larutan stok C, merupakan campuaran FeSO₄.7H₂O dan Na-EDTA, dibuat 100 kali dan dilarutkan ke dalam 200 ml aquades.

d.  Larutan stok D, merupakan larutan vitamin kecuali mio-inositol, dibuat 100 kali ke dalam 200 ml aquades.

e.  Larutan stok E, merupakan larutan mio-inositol, dibuat 100 kali dan dilarutkan ke dalam 100 ml aquades.

f.  Larutan Stok F, merupakan larutan ZPT, dibuat 100 kali dilarutkan ke dalam 500 ml aquades.

 2. Pembuatan Medium Kultur

a.  Aquades sebanyak 500 ml disiapkan di dalam erlenmeyer berukuran 1000 ml. Untuk pembuatan 1 liter medium, ditambahkan stok A 100 ml, stok B 5 ml, stok C 50 ml, stok D 50 ml, stok E 2 ml dan stok F : IAA (air kelapa) 15 ml.

b.  Sukrosa ditimbang sebanyak 30 gram dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer sambil diaduk.

c.  Aquades ditambahkan samapai volumenya 1000 ml.

d.  pH larutan diukur menggunakan pH meter elektrik hingga mencapai pH yang dibutuhkan yaitu 5,7 – 5,8. Jika terlalu asam tambahkan NaOH atau KOH 1 M, dan jika terlalu basa tambahkan HCl 1 M.

e. Sebanyak 7 gram agar-agar ditambahkan ke dalam larutan, lalu dpanaskan sampai mendidih sambil diaduk-aduk.

f.  Medium dituangkan ke dalam botol sekitar 20 ml.

g.  Botol ditutup menggunakan aluminium foil dan seal.

3. Sterilisasi Media

a.  Botol kultur yang sudah berisi medium dimasukkan ke dalam autoclave dengan tekanan 15 - 17,5 psi pada suhu 120 ^oC selama 20 menit, sampai tiga kali.

b.  Botol diangkat dan disimpan dalam ruang inkubasi sampai siap digunakan.

c.  Medium siap digunakan.

  

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

     Media MS

B. Pembahasan

Pembuatan media harus berdasarkan perhitungan konsentrasi yang tepat. Karena akan mempengaruhi keberhasilan tumbuh eksplan. Media yang digunakan merupakan media Ms (Murashige dan Skoog). Pada proses pembuatannya, unsure makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali, stok Fe 200 kali, vitamin 10 kali, ZPT 100 kali. Ditambakan pula sukrosa yang bertujuan untuk memberikan bahan baku metabolisme eksplan karena eksplan beum mampu menghasilkan asimilat seperti tumbuhan pada umumnya. Selanjutnya ditambahkan pemadat berupa agar “swallow” untuk memadatkan media.

Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari hormon (zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam tanah yang dikelompokkan ke dalam unsur makro dan unsur mikro. Hasil yang lebih baik akan dapat kita peroleh bila, kedalam media tersebut, ditambahkan vitamin, asam amino, dan hormon, bahan pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula maupun sukrosa, air destilata (akuades), dan bahan organik tambahan (Gunawan, 1988).

o   Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya bagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan karbohidart yang cukup sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan (1992), sukrosa adalah sumber karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi glukosa, maltosa, rafinosa. Namun jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula pasir cukup memenuhi syarat untuk mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi sebagai tekanan osmotik media.

o   Asam amino merupakan sumber N organik. Asam amino yang sering digunakan adalah glutamine, asparagin, sistein, dan glisin.

o   Vitamin berfungsi sebagai katalisator dalam system enzim dan diperlukan dalam jumlah kecil. Vitamin yang dibutuhkan pada sebagian besar kultur jaringan tumbuhanadalah thiamin, yang diberikan dalam bentuk Thiamin-HCl. Vitamin lain yang biasa digunakan adalah asam nikotinat dan piridoksin HCl (vitamin B6).

Pembuatan larutan stok pada dasarnya ditujukan untuk menyediakan bahan-bahan yang diperlukan pada pembuatan media dengan konsentrasi yang tepat. Karena media-media yang digunakan pada kultur jaringan diperlukan unsure-unsur dengan konsentrasi yang sangat kecil. Karena tidak dimungkinkan menimbang unsure dengan konsentrasi yang sangat kecil, maka dibuat lah larutan stok dengan menggunakan konsep kalibrasi, sehingga pada pembuatan media, unsure-unsur tersebut dapat digunakan seusia dengan konsentrasi yang diinginkan (Sriyanti, 2002).

Selain media MS yang digunakan, terdapat pula beberapa jenis media lain, diantaranya (Raharja, 1995):

1.   Heler
2.   White
3.   Nitsch & Nitsch
4.   Hildebrandt, Riker dan Duggar
5.   Gautheret
6.   Knudson
7.   VAcin dan Went
8.   Miller
9.   Linsmaier & Skoog
10.   Gamborg
11.   Murashige & Skoog
12.   White, diperkaya dengan fosfat dan diperkuat dengan senyawa organic seumber N serta asam amino.

   Media nomor 1 sampai dengan nomor 5 adalah media dasar yang hanya berisi unsure makro dan unsure mikro. Untuk keperluan kultur jarigan, media tersebut masih perlu ditambahkan bahan pelengkap berupa asam amino, vitamin, gula dan hormone tumbuhan. pH disesuaikan sehingga nilainya berkisar sekitar 5,6. Bahan-bahan lain yang dapat ditambahkan sebagai pelengkap misalnya ekstrak tauge, ekstrak ujunga kecambah jagung dan air kelapa muda (Raharja, 1995).

Beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain media dasar Murashige dan Skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur, media dasar B5 untuk kultur sel kedelai dan legume lainnya, media dasar White (1934) sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat, media dasar Vacin dan Went (1949) digunakan untuk kultur jaringan anggrek, media dasar Nitsch dan Nitsch (1969) digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel, media dasar Schenk dan Hildebrandt (1972) untuk kultur jaringan tanaman monokotil, media dasar WPM (Woody Plant Medium, 1981) khusus untuk tanaman berkayu, media dasar N6(1975) untuk serealia terutama padi. Untuk eksplan dari tanaman keras sering menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Kundson C cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek. Dari sekian banyak media dasar di atas, yang paling banyak digunakan adalah media Murashige dan Skoog (MS).

Keasaman pH adalah nilai derajat keasaman atau kebasaan dari larutan dalam air. Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H dalam larutan. Nilai di dalam pH berkisar antara 0 (sangat asam) sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk netral adalah pH pada 7. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0-6,0. Bila eksplan mulai tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman umumnya akan naik apabila nutrein habis terpakai. Pengukuran pH dapat dilakukan dengan menggunakan pH meter, atau bila menginginkan yang lebih praktis dan murah dapat digunakan kertas pH. Bila ternyata pH medium masih kurang normal, maka dapat ditambah KOH 1-2 tetes. Sedangkan apabila pH melampaui batas normal dinetralkan dengan penambahan HCL.

Menurut Gamborg dan Shyluk (1981) dalam Gunawan (1988), sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,5–5,8. Pengaturan pH, biasa dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL pada waktu semua komponen sudah dicampurkan .

Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian khusus. pH tesebut harus diatur sedemikian rupa,  hal ini ditujukan agar tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma, sehingga media yang dibuat sesuai dengan kondisi yang menjadi syarat untuk tumbuhnya eksplan dalam kultur jaringan. Selain itu, jika pH lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2, agar tidak dapat memadat. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan beberapa fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor:

o   Kelarutan dari garam-garam penyusun media.

o   Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam – garam lain.

o   Efisiensi pembekuan agar-agar.

Bahan pemadat media yang paling banyak digunakan adalah agar-agar. Agar-agar adalah campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam analisa unsur, diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan Na (Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992). Keuntungan dari pemakaian agar-agar adalah :

o   Agar-agar membeku pada suhu 45° C dan mencair pada suhu 100°C sehingga dalam kisaran suhu kultur, agar-agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil.

o   Tidak dicerna oleh enzim tanaman.

o   Tidak bereaksi dengan persenyawaan - persenyawaan penyusun media.

Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakantanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Contohnya komposisi Knudson C (1946), Heller (1953), Nitsch dan Nitsch (1972),Gamborg dkk B5 (1976), Linsmaier dan Skoog-LS (1965), Murashige dan Skoog MS(1962) serta woody plant medium-WPM (Lloyd dan Mc Known, 1980). Komponen media kultur yang lengkap dan yang harus diperhatikan dalam pembuatan media kultur adalah sebagai berikut :

o   Air distilata (akuades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solven.

o   Hara-hara makro dan mikro.

o   Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energy.

o   Vitamin, asam amino dan bahan organic lain.

o   Zat pengatur tumbuh.

o   Suplemen berupa bahan-bahan alami, jika diperlukan.

o   Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media.( Endang Yuniastuti. 2008: 5)

Untuk memenuhi factor pertumbuhan tanaman, maka factor – factor yang harus diperhatikan dalam pembuatan media kultur jaringan yang baik adalah media yang  mengandung:

1. Hara anorganik. Ada 12 hara mineral yang penting untuk pertumbuhan tanaman dan beberapa hara yang dilaporkan mempengaruhi pertumbuhan in vitro. Untuk pertumbuhan normal dalam kultur jaringan, unsur – unsur penting ini harus dimasukkan dalam media kultur. Perbandingan 5 media pada Tabel 12.1 memperlihatkan bahwa unsur esensial ini dimasukkan pada masing – masing media tapi konsentrasinya berbeda karena diberikan dalam bentuk yang berbeda.

2. Hara organic. Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrof dan dapat mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun tanaman in vitro dapat mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak menghasilkan vitamin dalam jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang sehat dan satu atau lebih vitamin mesti ditambahkan ke media. Thiamin merupakan vitamin yang penting, selain itu asam nikotin, piridoksin dan inositol biasanya ditambahkan. Selain bahan organik tersebut, bahan kompleks seringkali ditambahkan, termasuk ekstrak ragi, casein hydrolysate, air kelapa, jus jeruk, jaringan pisang, dan lain – lain. Penambahan bahan kompleks ini menghasilkan media yang tak terdefinisi. Dengan penelitian yang cukup, semestinya bahan kompleks ini dapat diganti dengan zat tertentu, mungkin tambahan suatu vitamin atau asam amino.

3. Sumber karbon. Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energy bagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh. Biasanya sukrosa pada konsentrasi 1 – 5% digunakan sebagai sumber karbon tapi sumber karbon lain seperti glukosa, maltosa, galaktosa dan laktosa juga digunakan. Ketika sukrosa diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk menghasilkan glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan lebih efisien oleh tanaman dalam kultur.

4. Agar. Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel. Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.7 – 1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganya tapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan. Pengganti lain seperti gelatin kadang – kadang digunakan pada lab komersial. Gel sintetis diketahui dapat menyebabkan hyperhidration (vitrifikasi) yang merupakan problem fisiologis yang terjadi pada kultur. Untuk mengatasi masalah ini, produk baru bernaman Agargel telah diproduksi ole Sigma. Produk ini merupakan campuran agar dan gel sintetis dan menawarkan kelebihan kedua produk sekaligus mengurangi problem vitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab dengan mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai agen pengental untuk 1 L media.

5. pH. media biasanya diatur pada kisaran 5.6 – 5.8 tapi tanaman yang berbeda mungkin memerlukan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2, agar tidak dapat memadat.

6. Zat Pengatur Tumbuh. Pada media umumnya ditambahkan zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh akan dibahas tersendiri pada minggu 13.

7. Air. distilata biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan ekonomi, menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol kandungan bahan organik dan non-organik pada media.

8. Pemilihan Media. Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam dan nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses digunakan pada berbagai tanaman dikotil. Untuk inisiasi kalus, 2.4-D ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1 – 5 mgL-1. Untuk multiplikasi tunas, sitokinin seperti BAP ditambahkan dan juga diberi auksin, seperti NAA pada konsentrasi yang rendah. Untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi 1 – 2 mgL-1 ditambahkan. Faktor yang paling sulit ditentukan dalam kultur jaringan adalah zat pengatur tumbuh dan biasanya perlu melakukan penelitian kecil untuk menentukan konsentrasi terbaik yang akan digunakan. Ada 2 pendekatan: Pendekatan pertaman adalah dengan menggunakan media dasar MS dan meneliti kisaran dua zat pengatur tumbuh yang berbeda pada media tersebut. (Anonimous, 2009).

Seperti halnya peralatan kultur, media yang digunakan juga perlu dilakukan sterilisasi untuk menciptakan kondisi lingkungan yang aseptic bagi eksplan. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperature 121Oc, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama.

Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up). Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin (Anonimous, 2009).

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. SIMPULAN

Berdasarkan hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa:

1.      Media kultur jaringan merupakan faktor penting penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin kebutuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula, protein, vitamin, dan hormon tumbuhan. Berhasilnya kultur jaringan banyak ditentukan selain kondisi aseptic juga oleh media tanam.

2.      Pembuatan larutan stok dilakukan dengan mengencerkan menggunakan aquades. unsure makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali, stok Fe 200 kali, vitamin 10 kali, ZPT berupa IAA dan Kinetin 100 kali.

3.      Pembuatan medium MS dilakukan dengan mencampurkan stok yang telah dibuat. Untuk pembuatan 1L medium, maka stok unsure makro diambil sebanyak 100 ml, stok unsure mikro diambil 5 ml, stok Fe diambil 5 ml, stok vitamin diambil 50 ml, stok ZPT untuk auksin dan sitokinin masing-masing 1 ml.

4.      Sterilisasi medium dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121⁰C pada tekanan 15-17,5 psi selama 20 menit.

B. SARAN

1.        Pembuatan larutan stok mikro dan stok mikro dalam media MS harus dilakukan dengan teliti agar eksplan dapat tumbuh dengan baik.

2.        Sterilisasi media harus dilakukan dengan baik, agar tidak terjadi kontaminasi.