LAP KULTUR JARINGAN (STERILISASI ALAT)

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bioteknologi di bidang pertanian telah berkembang pesat, salah satu contohnya adalah kultur jaringan. Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan atau organ tanaman dalam kondisi aseptis secara in vitro. Ciri teknik ini adalah kondisi kultur yang aseptis, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap, dan kondisi lingkungan kultur yang sesuai. Lingkungan yang sesuai dapat dipenuhi dengan menentukan media tumbuh yang sesuai dan penempatan pada kondisi yang terkendali berkaitan dengan intensitas dan periodisitas, cahaya, temperatur, dan kelembaban serta keharusan sterilisasi.

Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali (Sany, 2007). Konsep awal dari kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap.

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Seperti disebutkan sebelumnya bahwa kondisi yang aseptic merupakan syarat yang mutlak dalam tahapan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur.

Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan pun harus dalam kondisi aseptic. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun  peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut mutlak dilakukan terutama pada ruang  penabur atau tempat yang digunakan untuk penanaman eksplan.

B. Tujuan

Tujuan dari acara ini adalah untuk meningkatkan ketrampilan mahasiswa dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan menggunakan autoklaf. 

II. TINJAUAN PRAKTIKUM

Sterilisasi merupakan  suatu proses  untuk  mematikan semua organisme yang terdapat  pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja  yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-121 . Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:

a. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan  selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170– 180  dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas). 

b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol,larutan formalin).

c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba).

(http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20IV%20STERILISASI/IV2%20Sterilisasi %20Alat.ht)

Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode sterilisasi dengan uap air di bawah tekanan. Kapas penyumbat, kasa, perlatan laboratorium, plastik penutup, peralatan gelas, penyaring, air, dan media nutrisi dapat disterilisasi dengan autoklaf. Hampir semua mikroba mati bila terkena uap yang sangat panas dari autoklaf selama 10-15 menit/ semua obyek hendaknya disterilisasi pada suhu 121ºC dan tekanan 15 Psiselama 15-20 menit. (Torres, 1989).

Sebagai syarat mutlak suksesnya kultur jaringan tanaman, biasanya sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Bahkan autoklaf juga dapat digunakan untuk sterilisasi  media tumbuh kultur  jaringan. Tipe autoklaf  yang  dapat  digunakan untuk sterilisasi  sangatlah beragam macamnya, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram) (Gunawan, 1988).

Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan dari autoklaf ini adalah bahwa perlu adanya penjagaan dan pengaturan panas secara manual dan terkontrol, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan, yaitu: lebih sederhana sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan.

Biasanya untuk laboratorium komersial, menurut Gunawan (1988), diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable (memiliki program yang dapat diatur), panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.

III. MATERI PRAKTIKUM

A.   Alat dan Bahan

Bahan dan peralatan yang digunakan pada acara praktikum ini antara lain autoklaf, kompor serta gas, peralatan kaca/Glass ware (seperti botol kultur, Erlenmeyer, petridish, gelas piala), peralatan penanaman /Dissecting kit (seperti pinset, scalpel), aluminium foil, kertas paying, karet gelang, kertas merang, kertas pembungkus, plastic seal.

2. Prosedur Kerja

1.      Glass ware dan dissesting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu dikeringkan. Setel;ah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil dan dieratkan dengan plastic seal (segel plastik). Pinset dan scalpel dibungkus dengan kertas aluminium foil.

2.      Glass ware dan dissesting kit disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 120^oC pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit.

3.      Selama proses sterilisasi berlangsung, autoklaf ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan api, dilakukan selama tiga kali.

4.      Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai katup dibuka untuk membuang uap air hingga tekanan 0 psi.

5.      Autoklaf dibuka dan peralatan yang disterilisasi diambil.

6.      Peralatan disimpan di tempat yang bersih.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

No.	Nama Alat	Gambar	Keterangan
1	Autoclave		Alat sterilisasi peralatan dan media kultur jaringan
2	Timbangan Analitik		Untuk menimbang bahan dalam pembuatan media kultur jaringan
3	pH Meter		Untuk mengukur pH media kultur jaringan
4	Magnetik Stirer		Untuk mengaduk larutan dan memanaskan larutan
5	Botol Kultur		Untuk tempat menanam eksplan
6	LAF		Untuk tempat penanaman eksplan
7	Gelas ukur		Untuk mengukur suatu larutan
8	Erlenmeyer		Untuk menampung larutan
9	Seal		Untuk merekatkan alumunium foil pada botol kultur
10	Pipet		Untuk memindahkan larutan
11	Suntikan		Untuk memindahkan larutan dengan skala yang kecil dan terukur
12	Pembakar Bunsen		Untuk sterilisasi eksplan dan alat
13	Petridish		Untuk meletakan eksplan yang akar di kultur
14	Pinset		Untuk mengambil eksplan
15	Pengaduk Kaca		Untuk mengaduk larutan dalam pembuatan media kultur
16	Sarung Tangan (Gloves)		Untuk melindungi tangan dari panas
17	Karet Gelang		Unttuk mengikat alat-alat yang akan disterilkan
18	Aluminium foil		Untuk menutup botol kultur
19	Beker Glass		Untuk tempat membuat media/tempat melarutkan larutan
20	Kertas Payung		Untuk membungkus alat-alat yang akan di sterilisasi

B.  Pembahasan

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Seperti disebutkan sebelumnya bahwa kondisi yang aseptic merupakan syarat yang mutlak dalam tahapan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur.

Autoclave adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi media mikrobiologi, peralatan gelas laboratorium dan dekontaminasi atau membunuh bakteri. Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121⁰C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan.

Prinsip kerja autocalve:

o Proses Sterilisasi pada Autoclave adalah memanfaatkan panas dan tekanan uap dalam chamber.

o Panas dan tekanan tersebut dihasilkan oleh pemanasan elemen di dalam chamber yang dikondisikan menjadi hampa udara. 

o semakin besar setting waktu dan suhu yang digunakan maka semakin besar tekanan yang dihasilkan dalam chamber sehingga proses sterilisasi akan lebih cepat selesai.

o Tetapi dalam proses sterilisasi sudah ditentukan besarnya suhu dan lamanya waktu sterilisasi, tergantung pada hasil kualifikasi nya dan dari setiap bahan / alat yang akan disterilkan.

Adapun cara kerja yang baik dalam menggunakan autocalve antara lain, sebagai berikut :

o Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

o Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir, maka tutup harus dikendorkan.

o Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.

o  Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC.

o Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15’dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.

o Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

Bagian-bagian autoklaf :
1. Panci luar.
2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.
3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.
4. Katup pengeluaran uap.
5. Pengunci atau klem.

Komponen-komponen utama autoclave :

1. Pressure Gauge (Pengukur Tekanan Gas/Uap) ; tekanan yang disarankan    1,05-1,2 kg/cm²

2. Thermometer (Pengukur Suhu) ; suhu yang disarankan 121^o-125^oC

3. Exhaust Valve

a.       Saat sterilisasi dimulai, valve dinuka sampai ada uap air yang keluar dan menetes kemudian valve ditutup, tujuannya untuk kesempurnaan sterilisasi (pada saat velve dibuka gas/udara yang tidak steril keluar)

b.      Setelah sterilisasi selesai (tekanan menunjukan angka 0), valve dibuka kembali untuk mengeluarkan gas/uap yang tersisa

4. Automatic Pressure Regulating Valve (Sefety Valve) ; menjaga tekanan uap/gas tetap pada tekanan yang disarankan

 Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator ataupun pembakar bunsen.

Menurut Anonim (2009), khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Sebelum dimasukkan petridish, pisau scalpel , pinset, dan alat-alat yang lain (alat-alat logam dan gelas) terlebih dahulu dibungkus dengan kertas agar tidak kontak langsung dengan uap air autocalve. Petridish akan mudah rusak (pecah) jika mengalami kontak langsung dengan uap air yang panas. Sedangkan alat-alat seperti pisau scalpel dan pinset akan mudah berkarat jika berkontak langsung dengan uap air. Bagian yang ada tulisan dari kertas pembungkus harus diletakkan di bagian luar agar tinta yang larut nanti tidak mengotori alat yang ada di dalamnya.

Peralatan Kultur Jaringan

o   Cawan petri: Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawanyang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml,sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.

o   Botol kultur: Umumnya botol-botol kultur terbuat dari bahan yang tahan panas. Syarat botol kultur adalah dasarnya lebar dan mulutnya kecil, karena mulut botol yang lebar memungkinkan kontaminasi yang lebih besar. Sama seperti glassware yang lain sterilisasi botol kultur dengan autoclave tetapi sebelumnya dicuci bersih dengan deterjen dan dikeringkan. Ketika dimasukkan ke dalam autoclave mulut botol kultur ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet gelang.

o   Alumunium foil: adalah Alumunium foil lembaran aluminium tipis yang dapat dipakai untuk berbagai macam aplikasi memasak ataupun lainnya. Salah satu keuntungan dari menggunakan aluminium foil adalah karena sifatnya yang dapat digunakan kembali hingga beberapa kali. Di dalam kultur jaringan aluminium foil berfungsi untuk menutup botol kultur.

o   Seal : Seal digunakan untuk menutup botol kultur atau botol ukur. Tujuannya adalah untuk meminimalisir masuknya kontaminan ke dalam botol kultur atau bisa juga untuk mencegah bahan-bahan atau larutan dalam botol tumpah.

o   Kertas payung: Kertas ini digunakan untuk membungkus alat – alat kultur dan petridish sebelum disterillisasikan.

o   Karet gelang: Karet gelang digunakan sebagai pengikat penutup botol yakni plastik atau juga untuk mengikat kertas pembungkus petridish dan dissecting kit selama proses sterilisasi dengan autoclave.

o   Suntikan: Jarum injeksi digunakan untuk mengambil larutan stok dalam pembuatan media atau untuk memasukkan larutan (enzim) dalam pekerjaan isolasi protoplas ataupun untuk keperluan lain. Jarum injeksi ada dua macam yaitu yang terbuat dari plastik dan yang terbuat dari kaca. Jarum injeksi ada yang dapat disterilisasi dengan autoclave ada juga yang dengan mengganti jarum suntiknya.

o   Scalpel: scalpel atau pisau dalam kultur jaringan digunakan untuk mengiris atau memotong eksplan. Scalpel ada dua macam yaitu scalpel biasa yang dapat dipakai seterusnya (selalu disterilkan dengan autoclave) dan scalpel blits. Scalpel jenis blits mata pisaunya dapat dipasang menurut ukuran yang dikehendaki. Tangkainya dapat disterilkan dengan autoclave sedangkan mata pisaunya hanya sekali dipakai. Scalpel blits digunakan untuk mengiris bahan isolasi protoplas karena membutuhkan irisan yang sangat tipis (Daisy dan Ari, 2002).

o   pH meter: pH meter yang dipakai pada praktikum kali ini menggunakan pH meter otomatis. Pengukuran pH media, ujung sensor dimasukkan ke dalam larutan media, pada monitor akan muncul nilai pH media. Tinggal kita tambahkan NaOH jika terlalu asam dan HCl jika terlalu basa.

o   Gelas ukur: Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan. 

o   Erlenmeyer : Alat ini digunakan dalam kultur jaringan tanaman sebagai sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan.

o   Laminar Air Flow Cabinet (LAFC): Alat ini letaknya di ruang penabur, yaitu ruang yang selalu harus dalam keadaan steril. Alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman.

o   Shaker (penggojok) : Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita.

o   Sarung tangan: Sarung tangan adalah sejenis pakaian yang menutupi tangan, baik secara sebagian ataupun secara keseluruhan. Fungsi sarung tangan ialah untuk melindungi sang pemakai dari pengaruh lingkungan sekitarnya atau melindungi lingkungan sekitar dari tangan sang pemakai.

o   Timbangan Analitik : jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah timbangan yang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat keil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan.

o   Stirer : Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor di samping sebagai penggojok.

o   Pembakar spiritus: Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar spiritus. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol.

o   Tabung Reaksi: Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak ( deep tube agar ) dan agar miring(slants agar ). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alas an efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.

o   Pipet Tetes: Fungsinya sama dengan pipet ukur yaitu digunakan untuk memindahkan suatu cairan atau larutan, namun volume yang dipindahkan tidak diketahui. Salah satu  penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH saat mengatur pH media, penambahan reagen ada uji biokimia, dll.

o   Autoclave: Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 psi atau sekitar 2 atm dandengan suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi 2(15 psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC.

1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil). Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclave, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.

2. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet.

3. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.

4. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang.

5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121  pada tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai.

Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121 , tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi( pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :

1. Penguraian gula.

2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.

3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.

4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

( Lydiane Kyte & John  Kleyn. 1996 : 169).

Suhu  sterilisasi yang disarankan adalah 121°C, hal ini dikarenakan suhu tersebut  merupakan suhu kritis, dimana seluruh bentuk kontaminan tidak dapat bertahan hidup/mati. Sedangkan khusus untuk lama sterilisasi sifatnya disesuaikan dengan volume media yang  disterilisasi dan besarnya suhu yang diinginkan, Semakin banyak volume media maka semakin lama masa sterilisasinya. Biasanya untuk lama sterilisasi 20 menit, volume media yang digunakan berkisar 20-30 ml/botol atau 70-100ml/cup plastik atau 1 liter botol Schoolt atau 4 liter botol Erlenmeyer.

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. SIMPULAN

Ø  Berdasarkan data hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa sterilisasi peralatan kultur dilakukan sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan yang perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh, salah satunya dengan menggunakan autoclave pada suhu 121⁰C pada tekanan 15-17,5 psi. selama 30 menit. Beberapa peralatan yang di sterilisasi menggunakan autoklaf antara lain botol kultur, petridish, Erlenmeyer, aluminium foil, scalpel, dan pinset.

Ø  Bagian-bagian autoklaf :
1. Panci luar.
2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.
3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.
4. Katup pengeluaran uap.
5. Pengunci atau klem.

Ø  Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator ataupun pembakar bunsen. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

B. SARAN  

Sterilisasi alat harus dilakukan sesuai prosedur dan teliti agar tidak terjadi kontaminasi